Nicola Mustacchio ha conseguito la laurea in Medicina e Chirurgia presso l'Università degli Studi di Bari “Aldo Moro” con votazione 110/110 e Lode ed è iscritto all'albo dei Medici Chirurghi della provincia di Bari dal 1987. Si è successivamente specializzato in Chirurgia d'Urgenza e Pronto Soccorso nel 1991 con votazione 50/50 e Lode.
Assistente non di ruolo al Pronto Soccorso dell'O.C. di Alberobello (BA) dal 1992 al 1993, è stato assistente a tempo pieno, e poi aiuto a tempo pieno, di ruolo presso il reparto di Chirurgia Generale della Casa di Cura Polispecialistica Anthea di Bari dal 1993 al 2008. Dal 2008 al 2015 ha ricoperto il ruolo di Dirigente Medico, a tempo pieno, al Pronto Soccorso (U.O. di Medicina e Chirurgia d'Accettazione e d'Urgenza) dell' Azienda Ospedaliero Universitaria Consorziale Policlinico di Bari ed è ad oggi Dirigente Medico di ruolo, a tempo pieno, presso l'U.O. di Chirurgia Generale Universitaria III V. Bonomo Policlinico di Bari.
È autore di circa trenta pubblicazioni scientifiche edite a stampa, di argomento chirurgico e di altrettante relazioni e comunicazioni a vari congressi scientifici. Già vincitore del Premio Virgilio Chini per la migliore tesi di laurea dell' a.a. 1986–1987.